Лечението на безплодието за последните десетилетия значително се е подобрило. Лекарите са по- квалифицирани, опциите са се разширили, техниките се развиват постоянно.
Тъй като исторически погледнато първото раждане след ин витро оплождане е регистрирано през 1978 г., подобряването и създаването на нови техники за асистирана репродукция, като интрацитоплазмено инжектиране на сперматозоиди и физиологично интрацитоплазмено инжектиране на сперматозоиди са от голямо значение в днешно време. Луиз Браун е първото бебе, заченато чрез ин витро оплождане в Англия. Оттогава няколко изследвания в световен мащаб отчитат резултати за хора и животни. Този факт е разрешил проблемите на човешкото плодородие, създавайки нови начини за зачеване. Преди успеха на ин витро оплождането бяха разработени други техники за асистирана репродукция, като криоконсервацията. Сперматозите са първите клетки на бозайници, които се съхраняват в криоконсервация. Тези събития революционизират всички изследвания в областта на репродуктивната биология. Въпреки това, по отношение на криоконсервирането, трябва да се планира интензивна работа, тъй като все още се отчитат ниски нива на възстановяване. Подобряването на процедурите за затопляне на витрификацията е много важно, за да се увеличи развитието на ембрионите и резултатите от тях. Що се отнася за животните, то при тях свинските яйцеклетки са най-чувствителните клетки по време на витрификацията. Бъдещето на успеха на витрификацията е обещаващо. Поради това криобиолозите имат ангажимент в областта на асистираната репродукция. Целта на този преглед беше да се признае текущото състояние на техниките за асистирана репродукция, тяхното приложение, напредък и бъдещи перспективи.
През последните години условията за естествено оплождане са намалели при някои видове. При хората е известно, че тези трудности се дължат предимно на ендометриозата. Това е заболяване, при което тъкан от вътрешната обвивка на матката (ендометриумът, от endo – вътре, и metra – матка) се установява извън нея, обикновено в други органи в областта на таза. Това може да доведе до проблеми, като на първо място болки и безплодие. Ендометриозата се среща най-често при жени в репродуктивна възраст.
Ендометриумът е вътрешната обвивка на матката (лигавицата на матката). Ако отделената от яйчниците яйцеклетка бъде оплодена, тя се закрепя именно в ендометриума. Всеки менструален цикъл завършва с изхвърляне на маточната лигавица – това става по време на менструация.
Съобщава се за световно висока честота на синдрома на поликистозните яйчници и обструкция на фалопиевите тръби, рак, затлъстяване, азооспермия и олигозооспермия, така че създаването на техники за асистирана репродукция дава възможност за решение.
Принципи на криоконсервацията
Криобиологията е отрасълът на биологията, който изследва въздействието на ниските температури върху живите същества в земната криосфера или в науката. На практика, криобиологията се занимава с изследване на биологичен материал или система, при температури по-ниски от нормалните. Изследваните материали или системи могат да включват протеини, клетки, тъкани, органи или цели организми. Температурите могат да варират от умерено хипотермични условия до криогенни температури. Криобиологията е термин, извлечен от гръцките думи cryo – студ, bio- живот, logos- наука, който изследва ефектите от ниските температури в клетките и тъканите, за да се постигне тяхната криоконсервация. Процесите на криоконсервация позволяват поддържането на клетки, тъкани, органи и дори организми обикновено при ниски температури между -80 ° С и -196 ° С, като техният метаболизъм напълно се инактивира. Биохимичните реакции се спират за дълги периоди, запазвайки техния потенциал за развитие и осъществимост. В днешно време криоконсервирането се използва за опазване на гамети, така че и кривиологията, и ART (Assisted Reproduction Techniques) процедурите са се движели успоредно през последните 50 години.
Техниките за асистирана репродукция (ART) се отнасят до всички лечения, решаващи естествени проблеми с фертилността.
Криоконсервацията на ооцитите е от голямо значение в различни аспекти. При хората, тя може да помогне на тези, подложени на лечение за заболявания като рак и пациенти с проблеми с безплодието, да постигнат бременност чрез Техниките за асистирана репродукция.
В животинското производство витрификацията може да допринесе за генетичното подобряване на добитъка. Понастоящем в производствените предприятия се наблюдава спад в генетичното разнообразие на свине и други домашни видове, тъй като търговските искания са причинили неконтролирано свръхпроизводство. В допълнение, криоконсервирането е свързано със запазването на видове, застрашени от изчезване. Организацията по прехрана и земеделие на Организацията на обединените нации заяви, че има 20% загуба на генетични видове свине и коне, при които чрез използването на витрификация този факт може да бъде решен. Опазването на специфични гени е една от целите на криоконсервацията.
Дори, че е постигнат значителен напредък в криоконсервирането на гаметите, по-голямата част от извличането на яйцеклетките се състои in vivo . Провеждат се няколко проучвания с незрели яйцеклетки или ин витро произведени ембриони за криоконсервация. Въпреки това, възможността за криоконсервиране на гамети вече е включена в няколко центрове за плодовитост по света.
Методи на замразяване
Технологията на бавно замразяваща криоконсервация се постига, като се използват ниски концентрации на криопротектора и температурата се понижава постепенно. Скоростите на охлаждане бавно се произвеждат при някои видове биологични образци образуващи ледени кристали. Тази техника е широко използвана за криоконсервация на сперматозоиди, зрели овоцити и ембриони. Въпреки това бавното замразяване има няколко ограничения. Преди всичко тази процедура е много скъпа, защото изисква програмируемо оборудване за замразяване. Целият метод е изключително бавен. Но най-важното заключение е, че успешните резултати са овладяваме чрез витрификация при хора.
Използването на криопротективни агенти
Криопротективите са вещества, използвани за защита на клетката от увреждане, което възниква по време на витрификация и затопляне, главно поради образуването на ледени кристали и неадекватното обезводняване. Криопротективите променят физикохимичните свойства на разтворите- те са водоразтворими и ниско токсични молекули, които действат чрез намаляване на максималната температура. Освен това те понижават температурата, при която преминава преходът от вода към твърдо състояние, взаимодействайки с водните молекули, намалявайки способността му да образува връзки между тях. Също така те действат като установяват водородни връзки с други биологични молекули, като избягват факта, че губят първоначалната си структура и следователно клетъчната жизнеспособност.
Криопротективите се класифицират според пропускливостта в две групи: пропускливи (вътреклетъчни) и непропускливи (извънклетъчни).
Вътреклетъчнатите са с ниско молекулно тегло, което позволява висок дифузионен капацитет. Обичайно използваните при криоконсервиране на гамети, тъкани и други клетъчни видове са диметилсулфоксид (DMSO), гликоли като етилен гликол (EG) и алкохоли като пропандиол (PROH) и глицерол. Те действат главно чрез следните механизми: намаляване на точката на замръзване и взаимодействие с мембраната, запазваща нейната структура и предотвратяване на повишаването на високите концентрации на електролити, тъй като те са способни да се свързват с тях. Този факт също така позволява осмотичния поток на вътреклетъчната вода до извънклетъчното място, генерирайки дехидратация. Използването на високи концентрации на криопротективи при ниски обеми и комбинации между тях е от съществено значение за оптимизиране на процесите на криоконсервация, по-специално по време на витрификацията.
Използвани са няколко метода по отношение на експозицията на криопротектори. По време на „едноетапния“ метод клетките директно се поставят в хиперсимотичен разтвор по отношение на проникването на криопротектив. При процеса на отстраняване клетките с висока вътреклетъчна концентрация на криозащита се излагат на изотоничен солев разтвор. Въпреки това, осмотичните травми не се избягват. Бяха положени много усилия, за да се намали отрицателният ефект от „ветрификацията”. По принцип, се препоръчва използването на „многостъпалния“ метод. При него разтвор с висока концентрация на криопротективи се добавя към клетъчната суспензия стъпка по стъпка и концентрацията в клетката се увеличава постепенно. Този метод обаче се смята за по-скъп и практически труден.
Интрацитоплазмено инжектиране на сперма (ICSI) и физиологична интрацитоплазмена инжекция на сперма (PICSI)
В човешки и други видове бозайници са проведени голям брой проучвания, за да се постигне оплождане. Днес най-широко използван при хората е ICSI. Или това е Интрацитоплазменото инжектиране на сперма. При тази техника спермата се инжектира директно в отоцитната цитоплазма. Използването на тази техника ни връща в годината на 1962г, където се съобщава за процедурни проблеми. Тази техника заобикаля нормалното разпознаване и селекция на сперматозоиди по време на оплождането, което води до отказ от декондензация на сперматозоидите. Неуспехът на мъжкото ядрено образуване е една от основните причини за развитието на ембриона след ICSI. Въпреки това, живи раждания (10%) са получени след ICSI. Бе съобщено и за първото бебе, родено от ICSIС. Следват още успешни резултата. Досега ICSI е важна находка в асистираната репродукция. Неговото приложение и резултати са много успешни .
Тъй като е докладван слаб успех по ICSI процедурата при животните, новият подход към ICSI включва хиалуронова киселина (HA) за селекция на сперматозоиди. Методът PICSI се основава на способността на сперматозоидите да се свързват с хидрогела от НА, имитиращи естественото свързване на зрели сперматозоиди с ооцитите. В природата сперматозоидите срещат НА в кумулусните клетки, което позволява процеса на оплождане. Това е важно събитие, при което качеството на сперматозоидите се намесва при последващото развитие и имплантиране на ембриони.
Създаването и развитието на техниките за асистирана репродукция са от изключително значение за подобряване оплождането и развитието на ембрионите. Разработването на техники за криоконсервация, IVF, ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection) и PICSI (Physiological Intracytoplasmic Sperm Injection )революционизира областта на възпроизводството на хора и животни. Първата идея за криоконсервираните клетки при ниски температури, първото бебе, родено от техниката на IVF, началото на ICSI и успехът й през 1992 г. направиха и продължават да правят допълнителни подобрения. Например, процедурата PICSI е досега една от най-добрите техники за развитие на ин витро свински ембриони. Въпреки че процентите на преживяемост и развитие са все още по-високи при IVF, отколкото при ICSI или PICSI, тази процедура не изключва полиспермията. При криоконсервирането трябва да се планира упорита работа, тъй като все още се отчитат ниски нива на възстановяване. Подобряването на процедурите за затопляне на витрификацията е от изключително значемое, за да се увеличи развитието на ембрионите и да се подобвят резултатите. По отношение на домашните видове, свинските ооцити са най-чувствителните клетки по време на витрификацията. Бъдещето на успеха на витрификацията е обещаващо; поради това криобиолозите имат ангажимент в областта на асистираната репродукция. Иначе е изключително завладяващо за ембриолозите и репродуктивните биолози, които изучават механизмите, чрез които in vivo оплождането се осъществява чрез in vitro модели. Тези проучвания са отправна точка за развитието на нови технологии.